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姜大川 綜述 徐 燕 審校

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔內(nèi)科 安徽 合肥 230032 ）

[摘要] 牙周炎是一種細(xì)菌性感染性疾病，而牙齦卟啉單胞菌是牙周炎的主要優(yōu)勢(shì)致病菌之一。母雞在經(jīng)某種微生物免疫后，能產(chǎn)生針對(duì)此微生物的特異性抗體，且此抗體大量轉(zhuǎn)移到蛋黃中。經(jīng)提純得到的抗體，被稱為蛋黃免疫球蛋白（IgY）?？寡例l卟啉單胞菌 IgY 在防治牙周炎方面有著良好的前景。下面就 IgY 的性質(zhì)和特點(diǎn)、IgY 在牙周病治療中的應(yīng)用等研究進(jìn)展作一綜述。

[關(guān)鍵詞] 牙齦卟啉單胞菌； 蛋黃免疫球蛋白； 抗體； 免疫

[中圖分類號(hào)] R 780.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.3969/j.issn.1673-5749.2009.06.015

Anti-Porphyromonas gingivalis immunoglobulin yolk immune in prevention and treatment periodontitis

JIANG Da-chuan, XU Yan.（Dept. of Oral Medicine, The Affiliated Hospital of Stomatology, Anhui Medical Univer－sity, Hefei 230032, China）

[Abstract] Periodontitis is a bacterial infectious disease caused by microbial pathogens, and Porphyromonas gingivalis （P.gingivalis） is one of the prominent pathogens. Hen immunized with certain micro-organism can produce specific antibodies against the micro-organism，which can be transferred to the egg yolk in large numbers. The purification of the antibodies is also known as the immunoglobulin yolk（IgY） . Anti-P.gingivalis IgY may provide a promising insight into the prevention and treatment of periodontitis. This review reported the research progress of the nature and characteristic of IgY and the use of IgY in prevention and treatment of periodontitis research.

[Key words] Porphyromonas gingivalis； immunoglobulin yolk； antibody； immunity

       牙齦卟啉單胞菌為革蘭陰性厭氧菌，是牙周病，尤其是約占牙周炎患者 95%以上的慢性牙周炎病變區(qū)或活動(dòng)部位的主要優(yōu)勢(shì)菌，也是口腔固有菌群之一 [1] 。牙齦卟啉單胞菌含有一系列逃避宿主防御機(jī)制和破壞宿主組織的毒性因子 [2] 。近年來，隨著分子細(xì)菌學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展以及對(duì)牙周炎致病菌研究的深入，免疫防治牙周炎已備受關(guān)注。但由于齦下菌群的復(fù)雜性，故牙周炎免疫防治的研究進(jìn)展非常緩慢。母雞經(jīng)某種微生物免疫后，能產(chǎn)生針對(duì)此微生物的特異性抗體且此抗體大量轉(zhuǎn)移到蛋黃中，這種從蛋黃中提取的抗體稱為蛋黃免疫球蛋白Y（immunoglobulin yolk，IgY）。由于進(jìn)化的差異，蛋黃特異性抗體可與抗原上的多個(gè)抗原決定簇反應(yīng)，起到信號(hào)放大作用 [3] 且具有多種不可替代的優(yōu)點(diǎn)；因此，IgY 可作為一種廉價(jià)的易獲得的抗體，廣泛應(yīng)用于疾病的診斷和防治 [4-5] 。

1 IgY 的性質(zhì)和特點(diǎn)

1.1 IgY 的一般性質(zhì)

       雞蛋黃對(duì)抗體有濃集作用，使其不斷儲(chǔ)存于蛋黃中 [6] 。IgY 的相對(duì)分子質(zhì)量約為 180，所含的2 個(gè)亞單位為 65～70 的重鏈和 22～30 的輕鏈。IgY的結(jié)構(gòu)與 IgG 相似，但相對(duì)于哺乳類的 IgG，IgY的鉸鏈區(qū)短、可變性差且 Fc 段長(zhǎng)，因而具有兩大不可替代的優(yōu)勢(shì)。一是生物學(xué)優(yōu)勢(shì)：IgY 不激活補(bǔ)體，不與 Fc 受體和人類風(fēng)濕因子結(jié)合，與哺乳動(dòng)物間種系發(fā)生距離大，不會(huì)發(fā)生免疫球蛋白間的交叉血清學(xué)反應(yīng)，從而避免了免疫檢測(cè)過程中產(chǎn)生的假陰性或假陽性結(jié)果 [7] 。二是制備優(yōu)勢(shì)：IgY 耐熱、耐酸且穩(wěn)定性好，制備成本低、產(chǎn)出率高且提純簡(jiǎn)便快捷，均一性強(qiáng)。

1.2 IgY 的穩(wěn)定性

       為了使 IgY 在免疫防治中較好地發(fā)揮作用，抗牙齦卟啉單胞菌蛋黃免疫球蛋白免疫防治牙周炎在儲(chǔ)存、處理或治療過程中，抗體的穩(wěn)定性十分重要。IgY 具有耐熱、耐酸以及一定的抗酶降解的能力。1）IgY 耐熱：將 IgY 制劑于 4 ℃貯存 5年或室溫下放置 6 個(gè)月，其抗體活性幾乎不變 [8] ；將其溶解于生理鹽水中且于 4 ℃貯存 6～7年，抗體活性降低不超過 5%；將蔗糖、麥芽糖或甘油加入到稀釋的蛋黃抗體溶液中，可有效地阻止IgY抗體在 70 ℃時(shí)的變性，但在溫度超過75 ℃以后，IgY 抗體則出現(xiàn)變性 [9] 。2）IgY耐酸：當(dāng) pH 值大于 3 時(shí)，其抗體活性無明顯影響，尤其在 pH值為 5～7 時(shí)相當(dāng)穩(wěn)定；當(dāng) pH 值小于 3 時(shí)，其抗體活性明顯下降 [10] ；即使是在 37 ℃的胃蛋白酶作用下，蛋黃抗體的活性在 90 min 內(nèi)亦無改變。此外，IgY 還具有耐高滲的性能和較好地耐反復(fù)凍融的特性。

1.3 IgY 的安全性

       江千舟等 [11] 將雞蛋黃抗體凍干粉制備成噴漱液，經(jīng)口灌胃途徑給予昆明小鼠和威斯塔大鼠，觀察記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中毒癥狀和死亡情況后發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物情況良好，行為正常，未見明顯中毒癥狀和死亡發(fā)生；IgY 對(duì)血液學(xué)和生化學(xué)以及臟器系數(shù)（臟器質(zhì)量/動(dòng)物身體質(zhì)量）和組織病理學(xué)等指標(biāo)無明顯影響；IgY 無急慢性毒副作用，屬于無毒性類物質(zhì)，是一種安全有效的口腔局部預(yù)防制劑。因此，IgY 對(duì)尋求一種經(jīng)濟(jì)、安全和有效以及易標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的疫苗具有重要意義 [12] 。

1.4 IgY 的高產(chǎn)率和經(jīng)濟(jì)性
       少量的抗原刺激就能在免疫母雞的蛋黃中獲得大量而且能持續(xù)表達(dá)的 IgY 抗體 [13] 。經(jīng)抗原免疫的母雞，10 d 左右就可在其蛋黃中產(chǎn)生抗體，30 d 左右抗體量達(dá)到高峰，其特異性抗體的效價(jià)可持續(xù) 2～6 個(gè)月。傳統(tǒng)收集免疫動(dòng)物抗體，是通過采血或宰殺動(dòng)物來完成。但是，IgY 抗體的收集與傳統(tǒng)方法完全不同，它是通過收集免疫母雞的雞蛋，用各種免疫學(xué)以及生物化學(xué)方法從其蛋黃中提取純化抗體的 [14] 。單個(gè)雞蛋黃中的 IgY 的量可超過100 mg [15] 。1 只母雞在 1 個(gè)月中生產(chǎn)制備的蛋黃抗體相當(dāng)于 500 mL 的動(dòng)物血清抗體，且母雞的飼養(yǎng)成本更低。因此，這是一種簡(jiǎn)單易行、經(jīng)濟(jì)安全的獲得抗體的非侵入性方法，既減少了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的用量，也減少了對(duì)動(dòng)物的傷害。
2 IgY 在牙周病治療中的應(yīng)用

       牙周病是口腔的兩大常見病之一，與冠心病、腦卒中、慢性肺部感染、孕婦早產(chǎn)低身體質(zhì)量?jī)撼錾?、糖尿病、急性或亞急性感染性心?nèi)膜炎、動(dòng)脈粥樣硬化、心瓣膜炎和低血性心臟病等關(guān)系密切。目前，有關(guān)牙周炎治療主要包括基礎(chǔ)治療和牙周手術(shù)等。常規(guī)的機(jī)械治療和手術(shù)治療只能暫時(shí)控制菌斑、消除炎癥和阻止病變加重。重度牙周炎由于其牙周袋結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性導(dǎo)致刮治器械進(jìn)入困難，難以徹底地清除齦下致病菌，因而會(huì)造成病情的復(fù)發(fā)和加重。如果在機(jī)械治療的基礎(chǔ)上加以免疫方法輔助，提高局部組織中特異性抗體的滴度，就可能達(dá)到減少病原菌，防治牙周炎的效果。

2.1 牙齦卟啉單胞菌的免疫防治

       自 20 世紀(jì) 90 年代以來，各國(guó)學(xué)者都開展了針對(duì)牙周炎疫苗的研究。牙周炎是一種感染性疾病，菌斑細(xì)菌是其始動(dòng)因子。牙齦卟啉單胞菌含有一系列逃避宿主防御機(jī)制和破壞宿主組織的毒性因子。由于該菌菌體成分復(fù)雜，有些因子還有免疫抑制作用，因此牙周炎疫苗的發(fā)展趨勢(shì)是鑒定能夠提供免疫保護(hù)的抗原成分，如牙齦素、菌毛和血凝素等。牙齦素是牙齦卟啉單胞菌表面的精氨酸-賴氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，這些蛋白酶分別由 rgpA、rgpB 和 kgp 基因編碼。體外試驗(yàn)顯示，牙齦素可以降解多種宿主蛋白和蛋白酶抑制劑，水解補(bǔ)體 C 5 ，破壞細(xì)胞基質(zhì) [16] 。
       Kuboniwa等 [17] 編碼 kgp 催化區(qū)和 rgpA 催化區(qū)的質(zhì)粒免疫小鼠，所產(chǎn)生的 IgG 抗體可明顯地抑制牙齦卟啉單胞菌凝集紅細(xì)胞的作用，也能明顯地抑制精氨酸-賴氨酸特異性的蛋白水解活動(dòng)。許靜等 [18] 利用 PCR 技術(shù)和基因重組技術(shù)克隆牙齦卟啉單胞菌精氨酸牙齦素催化結(jié)構(gòu)域（rgpAcatalytic domain，rgpAcd）基因，并將其在大腸桿菌中表達(dá) RgpAcd 蛋白。張鳳秋等 [19] 成功地構(gòu)建了分泌型牙齦卟啉單胞菌牙齦蛋白酶 K 基因的真核表達(dá)載體 VR1020/KGPcd，并發(fā)現(xiàn)其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可正確地表達(dá)和分泌。上述研究，為進(jìn)一步研制重組載體疫苗奠定了基礎(chǔ)。
       菌毛是牙齦卟啉單胞菌菌體表面卷曲的絲狀蛋白附屬器，在細(xì)菌定植和侵入牙周組織的過程著重要的作用，而且其可刺激白細(xì)胞介素-1、6、8 以及腫瘤壞死因子和集落刺激因子等致炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致骨質(zhì)吸收和其他炎癥反應(yīng) [20] 。Sharma等 [21] 用人類共生菌格氏鏈球菌作載體表達(dá)于牙齦卟啉單胞菌菌毛蛋白功能區(qū)的 C 端和 N 端，口腔免疫無菌鼠，誘導(dǎo)產(chǎn)生了菌毛蛋白（fimbrilline，F(xiàn)im）A特異性的血清 IgG 和 IgA 以及唾液 IgA 抗體反應(yīng)，降低了牙齦卟啉單胞菌引起的牙槽骨喪失。國(guó)外學(xué)者純化了相對(duì)分子質(zhì)量為1.3×10 5 的血凝素蛋白 A，并利用其轉(zhuǎn)基因小鼠獲得人單克隆抗體。這種抗體對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量為1.3×10 5 的血凝素有高度特異性和親和力，能顯著地抑制牙齦卟啉單胞菌的血細(xì)胞凝集作用和囊泡，因此可能在牙周炎的被動(dòng)免疫治療中起作用 [22] 。

2.2 抗牙齦卟啉單胞菌 IgY 的應(yīng)用

       周萍等 [23] 對(duì) 100 例慢性牙周炎患者進(jìn)行了分組臨床實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組使用特異性抗牙周病 IgY 抗體牙周滴注治療牙周病，對(duì)照組進(jìn)行常規(guī)牙周病治療，分別就患者的牙齦指數(shù)、菌斑指數(shù)、牙齦出血指數(shù)和牙周袋深度進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)特異性抗牙周病 IgY 對(duì)慢性牙周炎具有良好的臨床療效。Yokoyama等 [24] 發(fā)現(xiàn)，抗牙齦卟啉單胞菌重組外膜蛋白 IgY 可特異性地識(shí)別該菌的外膜蛋白并與其功能性多肽位點(diǎn)結(jié)合，阻止牙齦卟啉單胞菌在牙周組織的定植，有效地降低牙齦素的水解活性，減小對(duì)細(xì)胞基質(zhì)的破壞。抗牙齦卟啉單胞菌IgY被認(rèn)為是治療牙周炎的新型有效制劑。此外，他們還用牙齦卟啉單胞菌免疫 5 個(gè)月齡的白來杭雞，將所獲取的 IgY 制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 20%的軟膏用于潔刮治和根面平整后的牙周炎患者，結(jié)果使用該軟膏患者的臨床癥狀和牙齦卟啉單胞菌的數(shù)量都好于未使用者 [25] 。該研究是利用牙齦卟啉單胞菌進(jìn)行被動(dòng)免疫治療牙周炎的重大嘗試和進(jìn)步。

3 結(jié)語

       從理論上講，用致病菌的有效免疫抗原作為疫苗來防治牙周炎是可行的。雞蛋中的抗體含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他哺乳動(dòng)物的血清，鑒于其安全性、生物學(xué)優(yōu)勢(shì)和制備簡(jiǎn)便，在試劑制備、疾病防治方面已經(jīng)引起了較多學(xué)者的關(guān)注。牙齦卟啉單胞菌是牙周病的主要優(yōu)勢(shì)菌之一，將抗牙齦卟啉單胞菌 IgY 制備成藥劑用于牙周炎的免疫防治，在被動(dòng)免疫防治牙周炎領(lǐng)域具有良好的前景。

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（本文編輯 劉世平）