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胡國柱　聶榮慶 　張進　文珠　唐寧

【摘要】　目的:使用牙齦卟啉單胞菌(P.g)誘導產(chǎn)蛋母雞特異性 IgY抗體產(chǎn)生及制備, 特異性 IgY抗體抑制 P.g及其它牙周病病因菌生長。 方法:采用免疫接種、水稀釋、鹽析、液體培養(yǎng)抑菌及 ELISA等方法, 誘導、提純 IgY抗體, 抑制 P.g及其它牙周病病因菌生長。 結果:誘導產(chǎn)生的 IgY抗體經(jīng)硫酸銨鹽析提取純度達 87.6% ～ 89.1%, IgY特異性結合牙齦卟啉單胞菌抗原的結合效價 1∶1 600。 制備的抗牙齦卟啉單胞菌 IgY抗體與牙齦二氧化碳噬纖維菌、中間普氏菌、伴放線放線桿菌、具核梭桿菌等牙周病致病菌的交叉免疫反應抗原結合效價分別為 1∶800、1∶800、1∶6 400、1∶12 800。 抗牙齦卟啉單胞菌 IgY在 5.0、1.0、0.1 g/L時, 分別與牙齦卟啉單胞菌、牙齦二氧化碳噬纖維菌、伴放線放線桿菌、中間普氏菌、具核梭桿菌、粘性放線菌、變形鏈球菌等厭氧菌在(1×10 8 )CFU/L和(5×10 8 )CFU/L時培養(yǎng) 24 h和 72 h均有不同程度的抑制其生長作用。 結論:牙齦卟啉單胞菌免疫產(chǎn)蛋母雞誘導產(chǎn)生的特異性 IgY抗體在一定的濃度內(nèi)有抑制牙齦卟啉單胞菌生長, 以及抑制多種牙周病致病菌生長的作用。牙齦卟啉單胞菌與這些牙周病病因均存在著共同抗原, 其可能具有防治牙周病的前景。

【關鍵詞 】　牙齦卟啉單胞菌 ;牙齦二氧化碳噬纖維菌;中間普氏菌 ;伴放線放線桿菌 ;具核梭桿菌;粘性放線菌 ;變型鏈球菌 ;IgY;細菌抑制

PreparationofIgYagainstPorphyromonasgingivalisandgrowthsuppressionofthesuspectedpathogensofperiodontaldiseasebyIgYagainstPorphyromonasgingivalis

HUGuozhu1, NIERongqing2, ZHANGJin2, WENZhu3 , TANGNing 4 .1.330006 Nanchang, InstituteofClinicalMedicicalSciences, JiangxiProvincePeople'sHospital,China;2.JiangxiAcademyofTraditionalMedicineandPharmacology, Nanchang;3.JiangxiInstituteofMedicalScience, Nanchang;4.ShenzhenXiliPeople' sHospital

【Abstract】Objective:ApplyingPorphyromonasgingivalisimmunizinghentoinducespecificIgYproduction, andtoobservetheIgYef-ficacyvalueagainstPorphyromonasgingivalis.Methods:Usingimmunization, water-dilution, ammoniumsulfateprecipitation, ELISA,andinhibitingbacteriagrowthtestinliquidanaerobicculture, theIgYwereinduced, extracted, purified, andtheIgYefficacyvaluea-gainstPorphyromonasgingivaliswasobserved.Results:TheIgYpurityreachedto87.6% -89.1% aftersaturationammoniumsulfateprecipitation.TheIgYefficacyvalueagainstPorphyromonasgingivaliswas1∶1600/mgprotein.TheIgYefficacyvalueagainstCapnocy-tophagagingivalis, Prevotellaintermedia,ActinobacillusactinomycetemcomitansandFusobacteriumnucleatumwere1∶800, 1∶800, 1∶6400, 1∶12 800 /mgproteinincross-reactivity, respectively.WhentheIgYconcentrationsofanti-Porphyromonasgingivaliswere5.0,1.0, 0.1 mg/ml, theIgYwasculturedseparatelywithPorphyromonasgingivalis, Capnocytophagagingivalis, Actinobacillusactinomyce-temcomitans, Prevotellaintermedia, Fusobacteriumnucleatum, ActinomycesviscosusandStreptococcusmutansinthe1×10 8 CFU/Land5×10 8 CFU/Lfor24hand72 h.Thegrowthofthesesuspectedpathogensofperiodontaldiseasewasinhibitedinvariousdegrees.Conclusion:ThehenisabletobeinducedtoproducetheIgYofanti-PorphyromonasgingivalisbyPorphyromonasgingivalis.ThespecificIgYofanti-PorphyromonasgingivalisiscapableofinhibitingthegrowthofPorphyromonasgingivalisandtheothersuspectedpathogensof \periodontaldiseases.TherearecommonantigensbetweenPorphyromonasgingivalisandtheothersuspectedpathogensofperiodontaldis-eases, andtherearecrossimmunizingreactivitybetweenthem.Itmayhavetheprospectofperiodontaldiseasepreventionandtreatment.

【Keywords】　Porphyromonasgingivalis;Capnocytophagagingivalis;Prevotellaintermedia;Actinobacillusactino-mycetemcomitans;Fusobacteriumnucleatum;Actinomycesviscosus;Streptococcusmutans;Immuno-globulinY;Bacteriasuppression

         牙齦卟啉單胞菌 (Porphyromonasgingivalis, P.g) 是慢性齦緣炎、慢性牙周炎 、侵襲性牙周炎等牙周病的主要可疑致病菌 ,其菌毛能夠與口腔上皮細胞表面的甘油醛 -3 -磷酸脫氫酶結合[ 1], 侵入牙齦上皮細

胞[ 2]和牙齦成纖維細胞[ 3],逃避免疫清除。牙齦卟啉單胞菌產(chǎn)生二肽酰氨肽酶降解結締組織, 促進 MMP-2· 337 · 實用口腔醫(yī)學雜志(JPractStomatol)2010 May, 26(3)

和 MMP-1活性增加[ 4]。牙齦卟啉單胞菌的精氨酸和賴氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶 (RgpA、RgpB、Kgp)能水解 IL-12導致 IFNγ產(chǎn)生減少[ 5-6]。部分牙齦卟啉單胞菌菌毛能夠誘導巨噬細胞表達 IL-1α、IL-1β、IL-6、TNFα導致牙槽骨破壞[ 7]。本文研制特異性抗牙齦卟啉單胞菌 IgY(YolkImmunoglobulins)抗體 , 并觀察其抑制牙齦卟啉單胞菌及其它牙周病致病菌生長, 目的是為牙周病的生物防治提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

       牙齦卟啉單胞菌 (P.g)ATCC33277;牙齦二氧化碳噬纖維菌 (C.g)ATCC33624;中間普氏菌 (P.i)ATCC25261;伴放線放線桿菌 (A.a)ATCC29523;具核梭桿菌(F.n)ATCC10953;粘性放線菌 (A.v)ATCC15987;變形鏈球菌 (S.m, MT6R, C型 )(以上菌種均購于四川大學華西醫(yī)學院口腔醫(yī)學研究所)。福氏完全佐劑 (批號 014 K8927, SIGMA-ALDRICH, INC., 美國 )和福氏不 完全佐劑 (批號 112 K8930, SIGMA-ALDRICH, INC., 美國 )。海蘭褐母雞 (南昌蓮塘種雞廠 ,中國), BHI液體培養(yǎng)基 (Difco公司 , 美國 ), 硫酸銨 (AR,批號 040602, 上海試四赫維化工有限公司 )。厭氧培養(yǎng)箱 (DY-2型 ,浙江義烏冷凍機總廠),酶標儀(WellscanMK3,芬蘭)。

1.2　方法

1.2.1　免疫接種　按常規(guī)方法免疫。將牙齦卟啉單胞菌與福氏完全佐劑或福氏不完全佐劑制備成油包水免疫原 ,皮下免疫海蘭褐產(chǎn)蛋母雞每 2周 1次,共 3次。

1.2.2　抗牙齦卟啉單胞菌 IgY的制備 　按文獻 [ 8]方法進行。

1.2.3　IgY純化 　使用 55%和 33%飽和硫酸銨兩步鹽析沉淀純化 IgY。

1.2.4　IgY效價測定　采用間接 ELISA法, 按常規(guī)操作進行 。

1.2.5　IgY溶液蛋白含量測定 　應用 Lowry法, 按常規(guī)操作進行 。

1.2.6　IgY蛋白純度測定 　應用非還原性 SDS-PAGE,按常規(guī)操作進行 。

1.2.7　抑菌試驗 　牙齦卟啉單胞菌及其它牙周病致病菌厭氧培養(yǎng) 48 h, 經(jīng)鑒定后將數(shù)個典型菌落混懸于BHI培養(yǎng)基 ,調(diào)整菌液濃度為 (2 ×108)CFU/L～ (1 ×109)CFU/L。用無菌的 BHI培養(yǎng)基對 IgY進行稀釋,調(diào)整抗牙齦卟啉單胞菌 IgY濃度為 10.0、 2.0、 0.2、0.0 g/L。取牙齦卟啉單胞菌或其它牙周病致病菌菌液 100 μl置于 96孔培養(yǎng)板中, 再加各濃度組 IgY100μl,每組 3孔 。空白對照孔不加菌液只加 BHI培養(yǎng)基 。將 96孔培養(yǎng)板于 37 ℃、厭氧培養(yǎng) 24 h和 72 h。

1.2.8　A值的測定　取厭氧培養(yǎng) 24、72 h的 96孔培養(yǎng)板,用酶標儀測 A 490 , 讀取吸光度值 (A)。

1.3　統(tǒng)計方法

     統(tǒng)計學處理使用 t檢驗 。

2　結　果

2.1　抗牙齦卟啉單胞菌 IgY提取

     應用水稀釋法提取的不同批次的抗牙齦卟啉單胞菌 IgY的純度達到 31.4% ～ 34.6%,結合牙齦卟啉單胞菌的效價達 1∶400。

2.2　抗牙齦卟啉單胞菌 IgY的純化

不同批次的 55%飽和硫酸銨沉淀的 IgY純度達到 58.3% ～ 61.2%, 33%飽和硫酸銨進一步沉淀的IgY純度達到 87.6% ～ 89.1%;33%飽和硫酸銨純化的 IgY結合牙齦卟啉菌的效價為 1∶1 600。

2.3　純化的抗牙齦卟啉單胞菌 IgY的結合效價

2.4　純化的抗牙齦卟啉單胞菌 IgY對牙齦卟啉單胞菌抑制作用

     當抗牙齦卟啉單胞菌 IgY終濃度在 5.0、1.0、0.1g/L時, 牙齦卟啉菌細菌濃度在(5 ×108)CFU/L和 (1×108)CFU/L,經(jīng) 24 h和 72 h的厭氧培養(yǎng) ,其抑制牙齦卟啉單胞菌生長率見表 2。

2.5　純化的抗牙齦卟啉單胞菌 IgY對其它牙周病致病菌抑制作用

     以終濃度為 5.0、1.0、 0.1 g/L的純化的抗牙齦卟啉單胞菌 IgY分別與 (5 ×105)CFU/L濃度的牙齦二氧化碳噬纖維菌、伴放線放線桿菌、具核梭桿菌、中間普氏菌、粘性放線菌或變形鏈球菌等進行 24 h和 72 h的厭 氧培養(yǎng),其抑制細菌生長率見表 3 ～4。

3　討　論

       牙齦卟啉單胞菌不但引起慢性齦緣炎 、慢性牙周炎 、侵襲性牙周炎等牙周病 ,而且與動脈粥樣硬化存在著相關性[ 9-10],目前無選擇性針對牙周病致病菌的預防和治療牙周病的藥物, 故本研究期望通過特異性被動免疫方法預防和治療牙周病。研究表明牙齦卟啉單胞菌不僅能夠誘導產(chǎn)蛋母雞產(chǎn)生特異性 IgY抗體, 而且其效價在免疫后第 4周達到高峰并維持 5個月, 此后效價下降,到第 8個月下降 80%。據(jù)此我們認為在第 5個月需要加強免疫 1次。
       本文結果證明特異性抗牙齦卟啉單胞菌 IgY與牙齦二氧化碳噬纖維菌、具核梭桿菌 、中間普氏菌、伴放線放線桿菌有不同程度的免疫交叉反應 (表 1), 從這個實驗推斷,可能誘導相同疾病的不同種屬的細菌之間存在許多相同的表面結構和功能, 以及相同的或近似的抗原決定簇 ,因此存在著交叉免疫反應。事實上Vasel等[ 11] 用牙齦卟啉單胞菌免疫猴子產(chǎn)生的抗牙齦卟啉單胞菌抗體也能與福塞類桿菌 (B.forsythus)產(chǎn)生交叉免疫反應 。牙齦卟啉單胞菌的菌毛素 (fimbrillin,FimA)的活性區(qū)域(activedomains)的結構在共生的格氏鏈球菌 (Streptococcusgordonii)上有表達 , 因此口服S.gordonii誘導產(chǎn)生的特異性血清 IgG和唾液 IgA可以阻止牙齦卟啉單胞菌所致的牙槽骨破壞[ 12]。我們也證明抗伴放線放線桿菌 IgY抗體不但抑制伴放線放線桿菌生長,同時也具有抑制牙齦二氧化碳噬纖維菌生長的作用,證明伴放線放線桿菌與牙齦二氧化碳噬纖維菌存在著共同抗原 13]。

       然而我們的研究也發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌誘導母雞產(chǎn)生的特異性 IgY效價明顯低于牙齦二氧化碳噬纖維菌、具核梭桿菌 、中間普氏菌、伴放線放線桿菌等誘導母雞產(chǎn)生的特異性 IgY的效價 (資料未顯示 ), 我們認為這可能與牙齦卟啉單胞菌上獨有的抗原決定簇弱或其表面可能存在著免疫抑制分子相關 。本文結果表現(xiàn)出牙齦卟啉單胞菌表面存在的與其它牙周病致病菌共有的抗原決定簇很強, 這也許證明生物學效應相同的不同種屬的細菌具有相同的抗原結構, 如本文所見特· 339 · 實用口腔醫(yī)學雜志(JPractStomatol)2010 May, 26(3)異性抗牙齦卟啉單胞菌 IgY與伴放線放線桿菌和具核梭桿菌的抗原結合效價更高, 分別為 1∶6 400和 1∶12 800。由于本文應用的 IgY是多克隆的, 因此能夠很好地表現(xiàn)出這一特點,我們推測這種現(xiàn)象具有一定的普遍性 ,這更具有抗菌廣譜性特點,有利于臨床應用。

       抗牙齦卟啉單胞菌 IgY與牙齦卟啉單胞菌共同培養(yǎng)不但能抑制牙齦卟啉單胞菌生長的作用 (表 2),而且也能較好地抑制牙齦二氧化碳噬纖維菌 、具核梭桿菌 、中間普氏菌、伴放線放線桿菌 、粘性放線菌 、變型鏈球菌等牙周病致病菌的生長 (表 3 ～ 4)。這個結果表明多克隆 IgY抗體有結合細菌的效價而具有抑制細菌生長功效。 有學 者證明在 皮室模 型 (subcutaneouschambermodel)中給于抗牙齦卟啉單胞菌 IgG促進牙齦卟啉單胞菌的清除 ,防止牙槽骨破壞[ 14]?？寡例l卟啉單胞菌 Mr40 000膜蛋白的 IgG抗體在補體的調(diào)理下促進粒細胞吞噬和殺死牙齦卟啉單胞菌[ 15]。本文還發(fā)現(xiàn)特異性抗牙齦卟啉單胞菌 IgY抑菌率并不完全與細菌結合效價成正比, 如抗具核梭桿菌和伴放線放線桿菌的效價是抗牙齦卟啉單胞菌的 4～ 8倍(表 1),但其抑菌率卻沒有差異。可能的原因有:①多克隆 IgY抗體中雖然都能與細菌結合, 但是多種抗不同抗原決定簇的抗體中有抗抑制細菌生長有關受體的抗體 (抑制性抗體), 其抑制細菌生長 ;也有抗刺激細菌生長有關受體的抗體 (刺激性抗體 ), 其刺激細菌生長;同時也有抗與生長、抑制無關的受體分子的抗體 ,其對細菌生長無影響 。 ②抗牙齦卟啉單胞菌 IgY與其它牙周病致病菌交叉反應的共同抗原受體可能主要是那些與生長 、抑制無關的受體分子,僅有少部分交叉反應的共同抗原受體與生長有關 ,或同時存在著一些刺激性生長受體抗原,故表現(xiàn)出 IgY對細菌結合力與其對細菌抑

制率不成比例的現(xiàn)象 。
       總之,本研究提示, 口腔含漱抗牙齦卟啉單胞菌IgY可能會有助于牙周病的預防和治療, 長時間使用甚至有可能達到治愈的目標。

參 考 文 獻

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(收稿:2009-07-04　修回:2009-10-13)