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常 　山 , 張雅萍 , 肖光夏 　　 ( 第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院燒傷研究所 , 重慶 400038)

　　提 　要 : 目的 　觀察抗白色念珠菌雞蛋黃抗體 IgY 的穩(wěn)定性與體外生物學(xué)效應(yīng)。方法 　用水溶法從免疫雞蛋黃中提取抗白色念珠菌抗體 IgY,ELISA 法檢測抗體耐熱、耐酸、耐堿的穩(wěn)定性 , 觀察 IgY 抑制白色念珠菌生長和抑制白色念珠菌粘附腸上皮細(xì)胞(IEC26)。結(jié)果 　 IgY 在巴氏消毒后活性為對照的 61 % , 在 pH 7 1 0 至 3 1 0 酸性環(huán)境中活性改變不顯著 , 在 pH 7 1 9 ,37 ℃作用 150 min活性仍為對照的 60 % 。 IgY 在 10 mg/ ml 時(shí)能明制白色念珠菌生長和對腸上皮細(xì)胞的粘附 , 明顯降低細(xì)胞上清二胺氧化酶(DAO) 釋放。結(jié)論 　雞蛋黃抗體 IgY 具有高度穩(wěn)定性和良好的體外生物學(xué)效應(yīng)。

　　關(guān)鍵詞 : 雞卵黃抗體 ;IgY; 白色念珠菌

　　中圖法分類號 : R392.1 　　　 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 : A

Stability and activities of immunoglobulin Y against Candida albicans IgY in vitro

CHANG Shan , ZHANG Ya 2 ping , XIAO Guang 2 xia (Institute of Burn Research , Southwest Hospital , Third Military Medical University , Chongqing 400038 , China)

　　 Abstract : Objective 　 To observe bio 2 activities and stability of egg immunoglobulin Y (IgY) against Candida albicans . Methods  IgYwaspurified with simple water dilution method (WD) from the eggs yolk of hens immunized with Candida albicans . The stabilities of IgY against acid ,alkali , and heat were measured with ELISA. The effects of IgYon the growth of the bacterium and on its adhesion to cultured intestinal cells(IEC 2

6) were studied. Results 　 The minimal ELISA positive titer of IgYwas 1 ∶ 12 800 and 61 % activity remained after pasteurization. The decrease of IgYactivity was not apparent at pH value from 7 1 0 to 3 1 0 , and 60 % activity remained after 150 min incubation at pH 7 1 9 and 37 ℃ . IgY at 10mg/ ml inhibited the growth of Candida albicans apparently and prevented the adhesion of the bacterium (10 5 cfu/ ml) to cultured intestinal cells and the DAO production. Conclusion 　 Egg yolk IgYagainst Candida albicans possesses its activities against Candida albicans in vitro , and shows sta 2ble properties to heat and acid or alkali environments.

　　 Key words : egg yolk antibody; IgY; Candida albicans

　　免疫雞蛋黃中含有大量來源于血清的 IgG 抗體( 又名 IgY) , 濃度遠(yuǎn)高于血清 , 且抗體提取簡單 , 來源十分豐富 , 近年來已引起了廣大研究人員的興趣。同時(shí)由于 IgY 的分子結(jié)構(gòu)與哺乳類 IgG 的差異使 IgY 的穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于哺乳類 IgG, 作檢測試劑時(shí)因不激活補(bǔ)體而比哺乳類 IgG 更精確。本研究用白色念珠菌作為抗原免疫產(chǎn)蛋雞 , 從蛋黃中提取出抗白色念珠菌 IgY,通過 ELISA 系統(tǒng)檢測其耐熱、耐酸、耐堿的穩(wěn)定性 , 同時(shí)觀察了其抑制白色念珠菌生長和抑制白色念珠菌粘附培養(yǎng)腸上皮細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng) , 為口服應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 　材料和方法

1.1 　抗白色念珠菌 IgY 抗體的制備

　　白色念珠菌 (CMCC 44104) 于 0 1 4 % 福爾馬林液中滅活后與等體積完全福氏佐劑混合乳化 , 作抗原皮下注射免疫 25 周齡Leghorn 雞 , 水溶法 ( 蛋黃溶于 9 倍蒸餾水 , 離心取上清并用硫酸鈉沉淀IgY)分離純化 IgY 并透析過濾除菌。紫外光雙波長測定 IgY 含量 ,SDS 2 PAGE 電泳檢測提取 IgY 的純度 , 細(xì)菌酶標(biāo)染色觀察 IgY 結(jié)合白色念珠菌的特異性。

1.2 　 ELISA 檢測 IgY 的效價(jià)、耐熱、耐酸和耐堿穩(wěn)定性

　　效價(jià) : 將 IgY 從 1 ∶ 200 倍比稀釋至 1 ∶ 25 600 檢測其效價(jià)。耐熱 : 將提取 IgY 分別置于 25 、 37 、 50 、 64 、 70 、 75 、 80 ℃孵育 15min 后稀釋 5 000 倍進(jìn)行 ELISA 檢測。耐酸 : 將 IgY 分別置于 pH值為 1 ,2 ,3 ,4 ,5 ,6 ,7 酸性環(huán)境中 37 ℃孵育 1 h 后稀釋 5 000 倍進(jìn)行 ELISA 檢測。耐堿 : 將 IgY 置于 pH 7 1 9 的液體環(huán)境中 37 ℃分別孵育 30 、 60 、 90 、 120 、 150 min 后稀釋 5 000 倍進(jìn)行 ELISA 檢測。 ELISA 操作步驟 : 白色念珠菌包被 96 孔酶聯(lián)板后依次加入 : 處理后 IgY 稀釋液 ( 每組 6 孔) ;兔抗雞 IgY 二抗 ; 最后加入鄰苯二胺底物顯色 30 min , 并用一滴 2 mol/L 硫酸終止反應(yīng) , 于490 nm 比色 ( 洗滌液為 0. 05 % Tween 2 20 , PH 7 1 4 0 1 01 mol/LPBS, 陽性對照分別為未加熱、酸和堿處理的 IgY 稀釋液 , 陰性對照的一抗為未免疫雞蛋黃提取物 ) 。

1.3 　 IgY 的體外生物學(xué)效應(yīng)

　　 IgY 抑制白色念珠菌生長 : 實(shí)驗(yàn)分 2 組 : ①對照組 :3 1 9 × 10 5cfu/ ml 白色念珠菌液于 37 ℃恒溫箱中孵育 , 于 6 、 12 、 24 、 32 h ,取樣后活菌計(jì)數(shù)。② IgY 拮抗組 : 將白色念珠菌(31 9 × 10 5 cfu/ml)分別加入 IgY10 、 5 、 2 1 5 mg/ ml , 于 6 、 12 、 24 、 32 h , 取樣后活菌計(jì)數(shù)。

　　 IgY 抑制白色念珠菌粘附培養(yǎng)腸上皮細(xì)胞(IEC2 6) : 將含白色念珠菌(5× 10 5 cfu/ ml) 的 DMEM 培養(yǎng)液和含同濃度白色念珠菌的 DMEM 培養(yǎng)液 ( 分別加入 IgY10 、 5 、 2 1 5 mg/ ml 于 37 ℃孵育預(yù)處理 30 min) 加入長腸上皮細(xì)胞的 96 孔板、每時(shí)相點(diǎn)設(shè)6 平行孔。觀察時(shí)相點(diǎn)為 : 加入白色念珠菌后 30 、 60 、 90 、 120 、150 min 。檢測指標(biāo)與方法 : ①粘附細(xì)菌數(shù) : 將各個(gè)時(shí)相點(diǎn)的培養(yǎng)孔去除上清 ,10 mmol/L pH 7. 4 PBS 沖洗培養(yǎng)孔 6 次 ( 每次200 μ l/ 孔) ,然后加入 0 1 25 % 胰蛋白酶2 0 1 02 %EDTA 消化液 100μ l/ 孔消化約 2 min 后接種于沙氏平板培養(yǎng) 72 h 后活菌計(jì)數(shù)。②上清液二胺氧化酶 (DAO) : 0 1 2 mol/L pH 7 1 2 的 PB 液 1 1 5 ml+ 二甲基聯(lián)苯胺 50 μ l + 尸胺底物溶液 50 μ l + 樣本 250 μ l +辣根過氧化物酶 50 μ l 共計(jì) 1 1 9 ml 置于 37 ℃水浴 30 min 于 436nm 比色。檢測時(shí)相點(diǎn)為粘附后 60 min 。

1.4 　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　　采用 t 檢驗(yàn)。

2 　結(jié) 　果

2.1 　 IgY 特異性、含量和純度

　　抗白色念珠菌 IgY 對該菌染色陽性而對綠膿桿菌 , 葡萄球菌染色陰性。提取物 IgY 含量平均為 13 1 7 mg/ ml 蛋黃液。將SDS 2 PAGE 電泳凝膠掃描 , 檢測 180 × 10 3 帶 (IgY) 所占百分比 , 得出 IgY 純度高達(dá) 95 % 。

2.2 　 IgY 效價(jià)和穩(wěn)定性

　　效價(jià) :ELISA 檢測出蛋黃 IgY 效價(jià)為 1 ∶ 12 800 , 而血清 IgG效價(jià)為 1 ∶ 6 400 。耐熱 : 以溫度為橫軸 , 以吸光值為縱軸 , 各溫度處理后的吸光值形成一曲線 ( 陽性對照 D 490 值為 1 1 841) , 見圖1 。曲線表明在 25 ～ 64 ℃作用后 IgY 的活性下降緩慢 ,64 ℃作用 15 min 后活性為對照的 61 % 。 64 ℃以上作用 15 min 后 IgY活性迅速下降。耐酸 : 以 pH 值為橫軸 , 以吸光值為縱軸作一光滑曲線 ( 陽性對照 D 490 值為 0 1 827) , 取陰性對照 D 490 值 0 1 24 為縱軸原點(diǎn) , 見圖 2 。曲線表明 IgY 在 pH 值為 3 以上時(shí)其活性改變不大 , 在 pH 值等于 3 時(shí)其活性為陽性對照的 70 % 以上 , 但在pH 值為 3 以下時(shí)其活性迅速下降。耐堿 : 以時(shí)間為橫軸 , 以吸光值為縱軸作一光滑曲線 , 取陰性對照 D 490 值 0 1 201 為縱軸原點(diǎn) , 作用時(shí)間為 0 的 D 490 值為陽性對照 D 490 值 , 見圖 3 。曲線表明 IgY 在 37 ℃ pH 值 7 1 9 堿性環(huán)境中 , 其活性隨時(shí)間延長下降緩慢 , 在作用時(shí)間為 150 min 后其活性接近陽性對照的 60 % 。

2.3 　 IgY 的體外生物學(xué)效應(yīng)

　　抑制白色念珠菌生長 : 白色念珠菌正常生長量和不同濃度IgY 作用下生長量見表 1 , 結(jié)果表明白色念珠菌在 24 h 內(nèi)為對數(shù)生長期 ,24 h 后進(jìn)入生長平穩(wěn)期 , 加入不同濃度 IgY 后白色念珠菌的生長受到一定程度的抑制 , 在IgY 濃度為 10 mg/ ml 時(shí)抑制作用最明顯且抑制時(shí)間最長。

　　抑制白色念珠菌粘附腸上皮細(xì)胞 : 白色念珠菌和加入不同濃度 IgY 處理后 , 于各時(shí)相點(diǎn)粘附培養(yǎng)腸上皮細(xì)胞菌量見表 2 。60 min 上清二胺氧化酶 DAO 見圖 4 。結(jié)果表明 : 白色念珠菌粘附腸上皮細(xì)胞高峰在 60 min , 不同濃度 IgY 均能抑制白色念珠菌的粘附 , 在 IgY 濃度為 10 mg/ ml 時(shí)抑制作用最明顯且抑制時(shí)間最長。

3 　討論

　　目前 IgY 已經(jīng)引起廣大研究人員的興趣 , 它主要有三個(gè)特性 : ①產(chǎn)量大提取簡便 ②具有高度的穩(wěn)定性和生物效應(yīng) ③作為診斷試劑干擾小。

　　本研究應(yīng)用簡便水溶法提取 IgY 的產(chǎn)量高達(dá) 13 1 7mg/ ml 蛋黃液 , 純度高達(dá) 95 % ,ELISA 滴度在 1 ∶ 12 800 ,且 IgY 只對白色念珠菌染色陽性 , 對綠膿桿菌和葡萄球菌染色均陰性 , 表明 IgY 來源豐富、純化簡便、具有

較好的特異性 , 是一種具有很高研究和應(yīng)用價(jià)值的抗體。

　　既往有學(xué)者采用抗體中和滴度法檢測 IgY 的穩(wěn)定性 , 發(fā)現(xiàn)其具有良好的耐酸 , 耐熱的理化性質(zhì)。本研究首次采用敏感的 ELISA 法對 IgY 的穩(wěn)定性進(jìn)行系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn) IgY 具有高度的穩(wěn)定性。 IgY 能耐受巴氏消毒(63

℃ 15 min) , 能耐受 37 ℃、 pH 值 3 以上的酸性環(huán)境1 h , 能耐受 37 ℃、 pH 7 1 9 堿性環(huán)境 150 min 。 37 ℃、 pH值 3 為通常狀況下胃環(huán)境 ,37 ℃、 pH 7 1 9 為通常狀況下腸道環(huán)境 . 因此上述結(jié)果表明 IgY 能夠通過食品工

業(yè)中常用的巴氏消毒法 , 口服后有望能在消化道保持高活性。這種穩(wěn)定的理化性質(zhì)對 IgY 作為口服藥物和診斷試劑都是十分有利和必要的。 IgY 優(yōu)良的穩(wěn)定性可能與其分子結(jié)構(gòu)有關(guān) : IgY 氨基酸及含糖量與哺乳類 IgG 有明顯差異 , 其分子結(jié)構(gòu)雖仍然為 2H + 2L , 但它與哺乳類 IgG 最大區(qū)別是 IgG 的 Fc 段缺少 IgY 的第2 恒定區(qū)(C2 ) 而代之以 IgG 出現(xiàn)了一個(gè)鉸鏈區(qū) (Hingeregion) , 而二者的抗原結(jié)合部位 F(ab) 尚未發(fā)現(xiàn)明顯不同。在某些雞蛋黃中天然含有 IgY 的 △ Fc 片段 , 而這種 △ Fc 片段比完整的 IgY 具有更高的穩(wěn)定性。上述事實(shí)說明 IgY Fc 段結(jié)構(gòu)變化對其活性有明顯影響。

　　本實(shí)驗(yàn)中 IgY 體外能明顯抑制白色念珠菌生長 ,抑制強(qiáng)度和時(shí)間與濃度呈量效關(guān)系。篩選出的 IgY 濃度 (10 mg/ ml) 能明顯抑制細(xì)菌生長達(dá) 24 h , 而前 24 h正是該菌的對數(shù)生長期 , 表明 IgY 具有良好的抑菌效果。同時(shí)在該濃度下 IgY 在各時(shí)相點(diǎn)能明顯抑制白色念珠菌對培養(yǎng)腸上皮細(xì)胞的粘附 , 其抑制效果同樣具有量效關(guān)系。 IgY 抗體抑制白色念珠菌生長主要機(jī)制可能為抗體封閉白色念珠菌表面抗原 , 防止白色念珠菌向菌絲體轉(zhuǎn)變 ; 引起凝集等。同時(shí)白色念珠菌是典型的粘附致病菌 , 特別在腸道 , 白色念珠菌感染的首要條件是通過菌體表面抗原粘附在腸上皮細(xì)胞上 , 因而抗體封閉菌體表面抗原對防止白色念珠菌感染將起到重要作用。二胺氧化酶 (DAO) 是一種控制腸粘膜增殖的細(xì)胞質(zhì)酶 , 主要存在于哺乳動物腸上皮細(xì)胞內(nèi)。腸上皮細(xì)胞受損時(shí) , 其細(xì)胞內(nèi) DAO 下降 , 而上清 DAO 明顯升高。因此 DAO 已成為反映腸上皮細(xì)胞因缺血和感染而受損的重要敏感指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用 IgY 處理白色念珠菌后 , 在粘附高峰明顯降低了腸上皮細(xì)胞 DAO的釋放 , 保護(hù)了細(xì)胞免受白色念珠菌的破壞。 IgY 抑制白色念珠菌生長、抑制其粘附腸上皮細(xì)胞的結(jié)果表明該抗體不僅具有良好的穩(wěn)定性和特異性 , 還具有高

度的生物學(xué)活性和高度結(jié)合抗原的能力。

　　目前已成功提取出抗蛋白質(zhì)、病毒、細(xì)菌的 IgY,并發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗病毒抗細(xì)菌的生物學(xué)效應(yīng) , 用于口服防治腸道病原體已取得良好效果。本研究制備出抗白色念珠菌 IgY, 發(fā)現(xiàn)該抗體產(chǎn)量高 , 穩(wěn)定性極好 , 具有很好的生物學(xué)效應(yīng) , 作為口服藥物或食品添加劑預(yù)防和治療病原性腹瀉和腸源性感染將具有廣闊的前景。

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( 編輯 　陳聰連 ）