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黃素晶，孟民杰

( 廣東藥學(xué)院 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

摘要: 由于卵黃抗體( IgY) 在分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)上的優(yōu)勢(shì)，使得 IgY 制備成了熱門(mén)的抗體研究領(lǐng)域。本文綜述了 IgY 在抗腫瘤、抗病毒、胃腸道疾病預(yù)防等方面的研究進(jìn)展，指出 IgY 可以用來(lái)替代傳統(tǒng)的 IgG抗體，具有廣闊的研發(fā)前景。

關(guān)鍵詞: 卵黃抗體; IgY; 檢測(cè); 防治

中圖分類號(hào): R392． 11 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A doi:10． 3969/j． issn． 1006-8783． 2013． 01． 025

文章編號(hào):1006-8783( 2013) 01-0106-05

Applications of immunoglobulin yolk in medicine

HUANG Sujing，MENG Minjie

( School of Life Science and Biopharmaceutics，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China)

Abstract: Because the molecular structure and biological advantage of immunoglobulin yolk ( IgY) ，it has beena hot spot in the field of antibody． This paper reviews recent development of IgY in tumor，virus and

gastrointestinal infection，and also suggest that IgY can replace traditional IgG antibody for a wide range of application in immunoassay，disease prevention and treatment．

Key words: immunoglobulin yolk; IgY; detection; prevention

       卵黃抗體( immunoglobulin yolk，IgY) 又稱卵黃免疫球蛋白，是通過(guò)特異性受體介導(dǎo)刺激下，由禽類 B 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生并轉(zhuǎn)移到卵黃中的多克隆抗體。與哺乳動(dòng)物抗體相比，其物種距離優(yōu)勢(shì)所帶來(lái)的針對(duì)哺乳動(dòng)物高保守蛋白的強(qiáng)反應(yīng)性，非常少量的抗原刺激就能在免疫雞蛋黃中獲得大量且能持續(xù)表達(dá)的特異性 IgY。近年來(lái)，由于 IgY 明顯的生物學(xué)特性優(yōu)勢(shì)，制備簡(jiǎn)單，在生物學(xué)領(lǐng)域已得到廣泛的應(yīng)用。

1 IgY 分子結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)

IgY 是雞蛋主要的抗體，其包含 2 條重鏈( 2H) 和2 條輕鏈( 2L) ，重鏈的形態(tài)類似希臘字母“ν”，分為 1個(gè)變化區(qū)和 4 個(gè)穩(wěn)定區(qū)，相對(duì)分子質(zhì)量65 105 000，而輕鏈包括 1 個(gè)變化區(qū)和 1 個(gè)穩(wěn)定區(qū)，相對(duì)分子質(zhì)量18 660 000，IgY 重鏈和輕鏈的結(jié)構(gòu)特殊，只有單拷貝的可變基因( V) 和功能基因( J) 進(jìn)行基因重組，雞主要通過(guò)基因轉(zhuǎn)化將基因從大量的假基因轉(zhuǎn)移至表達(dá)位點(diǎn)，以保證多樣性。雞抗體多樣性主要決定于基因轉(zhuǎn)變，使得生物體在種系功能性基因有限的條件下能迅速通過(guò)同源重組的方式，產(chǎn)生大量針對(duì)不同抗原的特異性抗體［1］ 。IgY 的 Fab 區(qū)域與哺乳動(dòng)物 IgG 的 Fab區(qū)域相似，含有抗原結(jié)合位點(diǎn)，然而 Fc 區(qū)域可激活補(bǔ)體，調(diào)理免疫功能及肥大細(xì)胞介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)［2］ 。卵黃抗體性能穩(wěn)定，IgY 在 60 ℃巴氏滅菌后活性不會(huì)下降［3］ ，在室溫下可存放 4 個(gè)月后仍保持部分的活性，4℃儲(chǔ)存數(shù)年活性無(wú)明顯的下降; 65 ℃時(shí) IgY 可保持活性 30 min 以上，80 ℃時(shí) 20 min 以上 IgY 活性才會(huì)完全消失［4］ 。在 pH4． 0 ～ 11． 0 時(shí)穩(wěn)定，在 pH3． 0 時(shí)活性迅速下降。而且 IgY 可抵抗幼齡動(dòng)物的胃酸屏障，抵抗腸道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化。

      隨著 IgY 提取和優(yōu)化技術(shù)的進(jìn)步，IgY 得到了廣泛應(yīng)用。由于 IgY 的低交叉反應(yīng)性，其物種距離優(yōu)勢(shì)所帶來(lái)的針對(duì)哺乳動(dòng)物高保守蛋白的強(qiáng)反應(yīng)性，因而在免疫檢測(cè)、臨床診斷、營(yíng)養(yǎng)保健品、特異性口腔產(chǎn)品可以替代抗生素預(yù)防和控制疾病等方面具有重要意義。

2 在腫瘤防治檢測(cè)方面的應(yīng)用

      人表皮生長(zhǎng)因子受體-2( HER2) 在乳腺癌等多種上皮源性腫瘤中過(guò)表達(dá)，與腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是人類某些癌癥的特異性標(biāo)志物。Xiao 等［5 －6］ 采用親和層析方法純化 IgY 抗體。用于檢測(cè)人體組織中的 Her2基因，結(jié)果表明 IgY 與其他哺乳動(dòng)物 IgG、IgM 相比，靈敏性和特異性更高。同時(shí)該特異性 IgY 抗體的單壁碳納米管( SWNT) 與抗 HER-2 雞 IgY 共價(jià)鏈接，該復(fù)合物能成功地用于體外特異性檢測(cè)和選擇性地殺死HER2 過(guò)表達(dá)的癌細(xì)胞。
      胸腺嘧啶核酸激酶 1( TK1) 水平變化與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，Wu 等［7］ 用 TK1 合成的肽片段免疫雞，采用親和純化，結(jié)果表明 IgY-TK1 可抑制 TK1 酶的催化活性，還可識(shí)別 TK1 四聚體。Huang ［8］ 采用免疫印跡-增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法對(duì)多名受試者進(jìn)行血清檢測(cè)，結(jié)果表明 TK1 可用于患者的早期預(yù)后和治療的監(jiān)控。
      最近表明與卵巢癌發(fā)生相關(guān)的蛋白 OVTA-1，用IgY 作為導(dǎo)向載體為尋求新的卵巢癌診斷方法提供理論依據(jù)［9］ 。
惡性腫瘤細(xì)胞膜分子常出現(xiàn)異常糖基化現(xiàn)象，它們?cè)诩?xì)胞間識(shí)別、黏附、炎癥反應(yīng)和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移中起重要作用。其中，N-羥乙酰神經(jīng)氨酸( Neu5Gc) 是某些癌癥的一種特異性標(biāo)志物。Diaz 等［10］ 采用親和純化 Neu5Gc IgY 抗體，用于檢測(cè)組織和治療性藥物中所含的 Neu5Gc 的糖蛋白，結(jié)果表明 Neu5Gc IgY 抗體 特 異 性 更 高。該 檢 測(cè) 方 法 已 申 請(qǐng) 專 利 ( US20100331770A1)
       由于非小細(xì)胞肺癌( NSCLC) 的早期診斷較困難，楊劍等［11］ 通過(guò)制備抗非小細(xì)胞肺癌相關(guān)多肽的 IgY 抗體，對(duì) NSCLC 患者和正常人的血清進(jìn)行檢測(cè)，研究表明 NSCLC 相關(guān)多肽 IgY 抗體特異性和靈敏度較高，進(jìn)而為 NSCLC 的診斷奠定基礎(chǔ)。

3 在病毒檢測(cè)方面的應(yīng)用
      史繼靜等［12］ 用純化的編碼 HIV-1-NCp15 蛋白免疫蛋雞，制備的 IgY 具有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)性，能夠與HIV-1 病毒蛋白 NCp15 特異性結(jié)合，從而為 HIV-1 診斷試劑盒開(kāi)發(fā)及進(jìn)一步研究 HIV-1 奠定基礎(chǔ); gp120 是HIV 病毒外殼殼層蛋白，Vaillant 等13］ 通過(guò) HIV-gp120多肽作為抗原免疫母雞，制備出抗 HIV-gp120 IgY 抗體，結(jié)果表明該抗體能與 HIV-gp120 特異性相結(jié)合，能為艾滋病的預(yù)防帶來(lái)新的途徑。

      甲型肝炎病毒( HAV) 能在自然環(huán)境中保持高穩(wěn)定性，在冰凍條件下也能存活。Paula 等和 Silva 等將重組 HAV 蛋白和 HAV 疫苗與 CPG-ODN 免疫佐劑聯(lián)合免疫母雞，結(jié)果表明免疫效果更佳，制備出抗 HAVIgY 抗體用于免疫檢測(cè)，特異性和敏感性都較高［14 －15］ 。

      人乳頭瘤病毒( HPV) 16 是高危型 HPV，與宮頸癌與宮頸上皮內(nèi)高度病變的發(fā)生相關(guān)，楊軍等［16］ 制備出高特異性的抗 HPV16L1 IgY，成功用于 HPV16L1 蛋白的免疫組織化學(xué)檢測(cè)，為 IgY 蛋白的檢測(cè)提供一種方法。

      流行性感冒構(gòu)成對(duì)全球人群健康的威脅，Michael［17］ 成功地制備出抗 H5N1 和 H1N1 流感病毒的特異性 IgY，可以用于被動(dòng)免疫預(yù)防和早期治療流感病毒感染。Kammila ［18］ 將特異性 IgY 應(yīng)用于免疫拭子試驗(yàn)

( immunoswab) 來(lái)檢測(cè)嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒( SARS-Cov) ，該方法能在 40 ～60 min 內(nèi)快速地檢測(cè)抗原濃度，可用于未來(lái) SARS 流行時(shí)疑似病例的快速診斷。
      腸道病毒 71 型( EV71) 感染除了能引起手足口病外，還能引起其他一系列神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的嚴(yán)重疾病如腦炎和脊髓灰質(zhì)炎的麻痹，Liou 等［19］用一滅活的EV71 菌株免疫產(chǎn)蛋母雞，用水稀釋法獲得 IgY，研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于感染EV71 病毒的小鼠，該抗體無(wú)論是作為腹腔注射還是口服都可以很明顯地降低發(fā)病率和致死率。

      輪狀病毒( HRV) 是引起嬰幼兒腹瀉的重要病原體，Vega 等［20］ 制備了抗 HRV-IgY，并作為牛奶添加劑，以初生小豬模型證實(shí)抗 HRV-IgY 能很好地控制腹瀉的癥狀，對(duì)預(yù)防初生嬰兒預(yù)狀病毒的感染提供了理論基礎(chǔ)。周玲等［21］ 采用抗輪狀病毒性雞卵黃免疫球蛋白( 百貝寧) 對(duì)輪狀病毒性腸炎患者進(jìn)行分組治療，治療組治愈率明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明百貝寧治療小兒輪狀病毒腸炎具有良好的效果。

4 抗菌治療中的應(yīng)用

      抗生素的廣泛使用使得很多細(xì)菌對(duì)它產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性。以細(xì)菌為抗原使母雞產(chǎn)生特異性 IgY 抗體，利用 IgY 抗體黏附與并緣聚的細(xì)胞壁上，抑制病原菌生長(zhǎng)的目的，具有良好的應(yīng)用前景。4． 1 IgY 在胃腸道疾病治療中的應(yīng)用。

      乳糜瀉( celiacdisease，CD) ，又稱麩質(zhì)敏感性腸病，是一種由于遺傳易感個(gè)體攝入麥麩物質(zhì)后引起的慢性7 0 1 第 1 期 黃素晶，等． 卵黃抗體 IgY 應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域的研究進(jìn)展小腸吸收不良綜合征，麩朊( gliadin) ，是主要的致病因子，Gujral 等［22］ 將已制備出的噴霧干燥的抗麩朊 IgY與 37． 5% 的甘露醇配制，獲得一種有效的抗麩朊 IgY膠囊，該特異性抗體的活性達(dá)到 99． 9%，膠囊在胃液模型中溶解 2 h 后，活性仍達(dá)到 82． 4%，同時(shí)提高了被動(dòng) 免 疫 治 療 的 敏 感 性，該 方 法 已 申 請(qǐng) 專 利( US20110008362A1) 。
      Greighoumi 的研究表明，沙門(mén)氏菌是作為一種通過(guò)食 物 傳 染 引 起 人 類 痢 疾 最 主 要 的 病 原 體［23］ 。Chalghoumi 等［24］ 分別使用含抗沙門(mén)氏菌的 IgY 粉和含抗鼠傷寒沙門(mén)氏菌外膜蛋白 IgY，在體外試驗(yàn)中，抗沙門(mén)菌的 IgY 能顯著抑制沙門(mén)菌對(duì)受感染的分化單層人腸道上皮細(xì)胞( Caco-2) 黏附作用，并且呈濃度依賴性。幽門(mén)      
      螺桿菌( HP) 是引起人類慢性活動(dòng)性胃炎、消化性潰瘍的重要致病因子，并與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。目前抗 HP 治療還沒(méi)有一種理想的藥物。Yang 等［25］利用抗 HP-IgY 抗體制劑在體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，16 mg/mL的 IgY 可以完全抑制細(xì)菌的生長(zhǎng); 病理切片表明，炎癥的消退更為明顯，IgY 可以與 HP 結(jié)合，阻止 HP 的黏附，降低 Hp 對(duì)胃黏膜的損害; 尿素酶測(cè)試中，IgY 能降低尿素酶水平。因此該 IgY 有望成為克服抗生素治療幽門(mén)螺桿菌介導(dǎo)的胃潰瘍所產(chǎn)生耐藥性的制劑。

4． 2 IgY 在口腔疾病治療中的應(yīng)用

      牙齦卟啉單胞菌是牙周病的主要致病菌，它與口腔其他細(xì)菌定植在一起形成牙菌斑，Rahman 等［26］ 制備了抗牙齦卟啉單胞菌蛋白酶( GP) IgY，體外試驗(yàn)表明，該 IgY 能顯著抑制 GP 的活性，在狗的試驗(yàn)中，抗Gp IgY 能顯著改善口腔的臨床指標(biāo)，包括改善了牙周炎、牙齦炎、牙結(jié)石和牙出血等狀況。

      變形鏈球菌是主要的致齲菌，齲病是牙體硬組織發(fā)生的一種慢性進(jìn)行性破壞性病變。體外實(shí)驗(yàn)表明，IgY 可以抑制變形鏈球菌生長(zhǎng)、繁殖和黏附而達(dá)到預(yù)防齲病的效果。Nguyen 等［27］ 通過(guò)志愿者的研究表明含抗變形球菌葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶( CA-GTF) IgY 抗體的含片能抑制變形鏈球菌在口腔的定植。羅鑫龍等［28］ 成功地將抗齲 IgY 應(yīng)用于牙膏中，研發(fā)生產(chǎn)了美加凈安全防蛀系列牙膏，研究表明，抗齲 IgY 及其牙膏可抑制變形球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌的黏附，改變菌斑的黏附狀態(tài)，對(duì)減少菌斑的形成作用顯著。

5 IgY 在其他方面的應(yīng)用

      嚴(yán)重?zé)齻?，腸黏膜機(jī)械屏障和免疫屏障受到破壞，固有菌群失調(diào)，這些均導(dǎo)致腸腔內(nèi)毒素( LPS) 進(jìn)入血液循環(huán)，爆發(fā)內(nèi)毒素血癥，導(dǎo)致全身感染及多功能障礙，甚至死亡，目前尚無(wú)有效的拮抗內(nèi)毒素的藥物應(yīng)用于臨床。甄宇紅等［29］ 以滅活的 E． coli O111 為抗原制備了特異性 IgY 抗體，研究發(fā)現(xiàn)該特異性抗體對(duì)內(nèi)毒素血癥的小鼠有保護(hù)作用，并且呈現(xiàn)劑量依賴性。Ma等［30］ 采用抗 LPS IgY 和抗 LPS Fab'片段對(duì)小鼠內(nèi)毒素血癥模型進(jìn)行研究，結(jié)果表明在不同的治療時(shí)間，抗LPS IgY 和抗 LPS Fab'片段都能降低小鼠的死亡率和抑制 LPS 誘導(dǎo)因子和抗炎性細(xì)胞因子的釋放。

      單增李斯特菌是一種人畜共患的致病菌，也是肉制品、奶制品以及水產(chǎn)食品中最為重要的病原菌，其生長(zhǎng)溫度范圍廣，難以有效控制食品的污染，它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞多。將滅活的單增李斯特菌免疫母雞制備特異性 IgY 抗體，分別在液態(tài)培養(yǎng)條件和固態(tài)培養(yǎng)條件下觀察 IgY 對(duì)單增李斯特菌的抑制效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，液態(tài)培養(yǎng)8 h、固態(tài)培養(yǎng)24 h 后，在存放6 ℃受單增李斯特菌污染的魚(yú)樣本的環(huán)境下，該抗體對(duì)單增李斯特菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著的抑制率效應(yīng)［31］ 。
      大腸桿菌能引起奶牛乳腺炎，從而導(dǎo)致牛奶質(zhì)量下降及其他后果，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。Shanmugam等［32］ 用 DEAE 離子交換劑純化抗大腸桿菌 IgY，效價(jià)最高能達(dá)到 1∶ 10 000，抗大腸桿菌 IgY 對(duì)菌株有顯著

的抑制作用。
      血吸蟲(chóng)病是一種嚴(yán)重危害人類健康的人獸共患寄生蟲(chóng)病，蔡玉春等［33］ 通過(guò)免疫母雞產(chǎn)生抗日本血吸可溶性蟲(chóng)卵抗原( SEA) 的特異性抗體，建立間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)( IHA) ，結(jié)果表明檢測(cè)日本血吸蟲(chóng)病循環(huán)

抗原具有較高的敏感性。Lei 等［34］ 采用基于 IgY 的免疫磁珠 ELISA 反應(yīng)檢測(cè)血漿中的循環(huán)抗原的量可以用來(lái)評(píng)價(jià)采用吡喹酮治療后的效果。
      Moussa 等［35］ 用提取的抗沙漠眼鏡蛇毒素的 IgY，

15 mg/mL 的 IgY 能夠中和 50LD50 的毒素，同時(shí)使用抗毒液的 IgY 幾乎沒(méi)有免疫副作用。Michael 等［36］ 純化制得的抗蝰蛇毒素 IgY 和鱗狀蝮蛇毒素 IgY，能夠中和蝰蛇和鱗狀蝮蛇毒素，同時(shí)有抑制水腫、減少溶血和

降低磷脂酶活性的作用。

6 基因重組 IgY

      利用禽類免疫球蛋白基因的多樣性的機(jī)制，可以從禽類的免疫組庫(kù)中克隆和選擇得到高效的抗原特異性的抗體片段?，F(xiàn)單價(jià)抗體 scFV 和 Fab 庫(kù)已建立［37］ 。

Greunke 等［38］ 重組 IgY 片段基因，通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生了 IgY 單抗，并表明該單抗不與類風(fēng) 濕因子( RF) 、人類鼠類高親和力受體 FCGR1( CD64) 和人類低親 和 力 受 體 FCGR3a ( CD16A) 結(jié) 合。用 重 組 的H5N1 禽流感病毒血凝素蛋白免疫雞的 cDNA 文庫(kù)中8 0 1 廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào) 第 29 卷得到雞-人嵌合 Fab 單克隆抗體，實(shí)驗(yàn)表明該抗體可以很好的應(yīng)用于 H5N1 的診斷［39］ 。在肺小細(xì)胞癌患者中能檢測(cè)出 α-烯醇化酶上調(diào)，Leu 等［40］ 利用噬菌體展示技術(shù)制備了 α-烯醇化酶的 mIgY 的 scFV，經(jīng) ELISA、流式細(xì)胞術(shù)免疫熒光技術(shù)表明，該抗體可以特異性結(jié)合α-烯醇化酶蛋白，為肺癌的診斷提供了新的方向。

7 小結(jié)與展望

近年來(lái)，美國(guó)、日本、德國(guó)等在 IgY 研究開(kāi)發(fā)中處于領(lǐng)先地位。已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化、商品化的 IgY 主要集中在口腔疾病及胃腸道疾病方面。同時(shí)，IgY 在食品上的應(yīng)用也日益增加，主要用于嬰兒食品和老年食品中，以提

高人體的免疫力，增強(qiáng)對(duì)各種疾病的抵抗力。如今，IgY 的研究范圍越來(lái)越廣，隨著 IgY 技術(shù)不斷地發(fā)展和基因重組技術(shù)的興起，在多克隆 IgY 的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的單克隆抗體 IgY( mIgY) 具有 IgY 的生物學(xué)優(yōu)勢(shì)，抗體專一性進(jìn)一步加強(qiáng)。此外可以從組合庫(kù)中，不需要進(jìn)行免疫也能獲得單克隆 IgY 和 IgY 相似的結(jié)構(gòu)。因此，相對(duì)于哺乳動(dòng)物 IgG，IgY 在診斷和治療的研究中顯示更大的優(yōu)勢(shì)。然而對(duì)于 IgY 的規(guī)模化生產(chǎn)和臨床應(yīng)用中存在的生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性、口服制劑在胃腸道的穩(wěn)定性等，尚無(wú)統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等問(wèn)題。但隨著 IgY技術(shù)深入的發(fā)展與研究，IgY 可以更加廣泛地應(yīng)用于疾病的預(yù)防和治療以及相關(guān)檢測(cè)等領(lǐng)域。

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( 責(zé)任編輯: 王昌棟)